„Dynamické“ mutace a některé neurologické nemoci


„Dynamické“ mutace a některé neurologické nemoci
16. března 2011 v 20:19 | Petr Kufner | Buněčná biologie a genetika
Nové objevy v molekulární biologii
MUDr. Petr Kufner

Biologické výzkumy v posledních letech odhalily molekulárně genetické příčiny řady dědičných neurologických onemocnění. Nahlédli jsme tak na etiologii nové skupiny geneticky definovaných nemocí. Tyto nemoci jsou způsobeny nově objeveným typem mutace, pro kterou je charakterický abnormální počet opakování (expanzí) tandémových sekvencí jednoho nukleotidového tripletu v DNA řetězci příslušného genu. Pro tyto poruchy je ražen termín „dynamické mutace“, který má vystihovat nestabilní a v generacích se měnící charakter mutace. Naše chápání se tak o podstatný kus posunulo z pouhého popisu symptomů až k vysvětlení molekulárních příčin těchto nemocí.
Jako první z těchto chorob byla po této stránce objasněna molekulárně genetická příčina syndromu fragilního X (syndromu Martin a Bellové). Již dlouho je známo, že mentální retardace se vyskytuje asi o 25% častěji u jedinců mužského pohlaví než u jedinců pohlaví ženského. V roce 1943 angličtí genetici J. P. Martin a J. Bellová publikovali rodokmeny, které podporovaly hypotézu, že přinejmenším část této převahy mentálních retardací u mužského pohlaví lze přičíst na vrub dědičné poruše recesívně vázané na chromozóm X. Další pozornost byla této hypotéze náležitě věnována až v roce 1969, kdy H. A. Lubs skutečně popsal u čtyř mentálně retardovaných mužů ve třech generacích téže rodiny cytologickou abnormalitu na chromozómu X, totiž sekundární konstrikci na jeho dlouhém raménku (fraXq). Když je kultura lymfocytů pacienta zbavena folátu nebo je porušen thymidinový metabolizmus, objeví se pod mikroskopem na distální části dlouhého raménka chromozómu X těchto pacientů zjevný zlom, takzvané fragilní místo. Nositelé abnormality fraXq27.3 jsou postiženi různě závažnou mentální retardací, někteří mají makroorchii (po pubertě dosahují varlata dvoj- až třiapůlnásobku normálního objemu). Častá je obličejová dysmorfologie s prominující dolní čelistí, velkou hlavou a zvětšenýma ušima, mohou být přítomny krátké a tlusté ruce, uvolněné klouby, někdy je zjištěn prolaps mitrální chlopně. Postižení chlapci jsou v dětství nadprůměrně vysocí, v dospělosti jsou malí. Mají opožděný vývoj řeči. V dětství jsou hyperaktivní nebo trpí autismem, v dospělosti ostýchaví a neasertivní, avšak přátelští. Tito muži přivedou na svět potomstvo jen zcela vyjímečně. Asi 20 % mužů, u nichž je přítomen patologický gen, však nemá fenotypový projev, jsou bez mentální retardace a mohou přivést na svět potomky. Narozené dcery jsou pak přenašečkami genu a mají postižené syny. Mutace se tak může projevit až o dvě generace později, totiž u synů jejich dcer, které jsou všechny přenašečkami. Bylo zjištěno, že počet čerstvých mutací je 7,2 x 10 – 4, což je frekvence relativně velmi vysoká (frekvence většiny lidských mutací dosahuje čísla o dva řády menšího). Mutace nikdy nevznikají ve vajíčku, nýbrž vždy ve spermii, což znamená kromě jiného, že postižení muži nejsou nikdy čerstvými mutanty.
Koncem sedmdesátých let byl tento syndrom rozpoznán jako nejčastější choroba vázaná na X chromozóm, s frekvencí kolem
1 : 1250 zdravých mužů. U žen se vyskytuje fraXq27.3 s frekvencí o něco nižší, zhruba 1 : 2000. Kromě tohoto syndromu je známo ještě asi dalších padesát mnohem vzácnějších poruch s mentální retardací, vázaných na chromozóm X, takže na zhruba 600 zdravých mužů připadá jeden mentálně postižený muž s dědičnou poruchou vázanou na chromozóm X, přičemž na samotný syndrom fragilního X připadá jedna čtvrtina těchto mentálních poruch. Takto je syndrom fragilního X hned po Downově syndromu (který má frekvenci asi 1 : 800 porodů plodů obojího pohlaví) druhou nejčastější příčinou mentální retardace u mužů.

Tabl. 1.: Expandované DNA triplety u neurologických onemocnění.
Onemocnění Triplet Gen Lokalizace
Syndrom fragilního X CGG FMR-1
Xq27.3
Syndrom fragilního X-E GCC FRAXE
Xq28
Syndrom fragilního X-F GCC FRAXF
Xq28
Spinální a bulbární svalová atrofie CAG SBMA
Xq11-12
Huntigtonova chorea CAG IT-15
4p16.3
Spinocerebelární ataxie typu 1 CAG
SCA-1
6p22-23
Dent.rubr.pallido-luys. dystrofie CAG
DRPLA
12p12
Machadova-Josephova nemoc CAG MJD-1 14q24.3-q32.1
Friedreichova ataxie GAA
X25
9q13-q21.1
Myotonická dystrofie CTG
DMPK 19q13.3

U normálních jedinců je v oblasti promotoru genu FMR-1 (tento gen se také v literatuře často nazývá FRAXA gen), tedy genu, který je zodpovědný za manifestaci syndromu fragilního X, normálně přítomno 5 až 54 opakování tripletu cytozin-guanin-guanin (CGG), u nosiček (které mívají často též sníženou inteligenci, ale jinak nebývají přítomny žádné fyzické abnormality) je těchto opakování 60 až 230, a u nemocných mužů 230 až 4000. Plně vyjádřená mutace je charakteristická ještě metylací DNA v promotorové oblasti genu FMR-1, která kompletně inhibuje expresi. Z uvedeného vyplývá, že syndrom fragilního X je způsoben ztrátou funkce genového produktu FMR-1.
Příbuzným syndromem doprovázeným mentální retardací lehčího stupně je syndrom fragilního X-E, při kterém je přítomna mutace na Xq28, a který je způsoben abnormálně zvětšeným počtem opakování tripletu GCC v genu FRAXE, vzdáleném distálně od genu pro syndrom fragilního X asi 600kb. Dalším fragilním místem na X chromozómu je fragilní X-F, jež se nachází asi 1 200 kb distálně od FRAXA. Zatím není známo, zda FRAXF souvisí s nějakým konkrétním lidským onemocněním, ačkoli několik mužů s touto abnormalitou vykazovalo opožděný psychomotorický vývoj.
FRA16A je prvním fragilním místem, které bylo zjištěno na autozómu (chromozóm 16). Jeho molekulárním podkladem je mohutně expandovaná repetice CCG (1000-2000 opakování). Důsledkem expanze je zřejmě hypermetylace celého lokusu FRA16A , která se rozšiřuje i na oblast CpG ostrova. Fragilní místa na autozómech nejsou spojena se žádnými známými nemocemi, snad proto, že dosud nebyla pozorována jejich homozygotní forma.
Nápadné podobnosti popsaných fragilních míst na chromozómech nás opravňují usuzovat, že všechna fragilní místa vznikají jako následek expandovaných tripletových repeticí, doprovázených hypermetylací CpG dinukleotidů.
Další nemocí způsobenou abnormální expanzí repeticí nukleotidových tripletů v genu je spinální a bulbární svalová atrofie (Kennedyho nemoc). Jedná se o progresívní neuromuskulární onemocnění mužů, vázané na chromozóm X. U nemocných se manifestuje slabostí a atrofií proximálních svalů, fascikulacemi, často též gynekomastií a testikulární atrofií s poruchami fertility. Jak bylo zjištěno v roce 1991, onemocnění je způsobeno zvýšeným počtem opakování tripletů cytozin-adenin-guanin (CAG) na prvním exonu SBMA genu na Xq11-12. Tento gen kóduje androgenní receptory. Normální jedinci mají na SBMA genu 12 až 34 opakovaných sekvencí CAG, postižení spinální a bulbární svalovou atrofií mají těchto sekvencí přibližně dvakrát tolik, totiž 40 až 62. Onemocnění je u mužů charakteristické částečnou androgenní insenzitivitou. Patologicko-anatomicky nacházíme degeneraci neuronů předních rohů míšních, bulbárních neuronů a dorzálních kořenových gangliových buněk. Jakým způsobem ovlivňují androgeny normální funkci a životnost motorických neuronů zůstává v současné době nejobjasněno, i když bylo pozorováno, že podávání testosteronu krysám zpomaluje motorickou neuronální degeneraci po axotomii.
V roce 1992 byly zjištěny expandované opakované nukleotidové sekvence cytozin-thymin-guanin (CTG) v genu pro myotonickou dystrofii (Steinertovu nemoc). Tato nemoc je charakteristická progresívní svalovou slabostí, myotonií, často jsou přítomny poruchy vedení srdečního elektrického impulsu, katarakta, hypersomnie, porušená glukózová tolerance, u mužů testikulární atrofie. Dědí se autozomálně dominantně. Klinická variabilita co do fenotypového projevu je zde značně široká, někteří pacienti jsou postiženi například jen kataraktou. Frekvence výskytu je 1: 8 000 normálních porodů. Gen pro myotonickou dystrofii zaujímá pozici na 19. chromozómu (19q13.2). Tento gen kóduje cAMP dependentní serin-treonin proteinkinázu (DMPK). V normální populaci se v něm vyskytuje 5-35 opakování tripletu CTG, u nemocných s lehčím postižením je jich 50 až 80, a u těžkých forem až přes 2000.
V roce 1993 byla objasněna molekulární podstata další neurodegenerativní nemoci, Huntingtonovy chorey. Nemoc byla poprvé popsána Georgem Huntigtonem v roce 1872 u amerického potomka anglického přistěhovalce. Existuje hypotéza, že gen pro Huntingtonovu choreu se rozšířil ze západní Evropy do celého světa. Odhady heterozygotní frekvence v různých populacích se pohybují od 1 : 5000 do 1 : 15 000, s výjimkou relativně izolovaného regionu ve Venezuele, kde je výskyt nepoměrně častější. Nové mutace jsou velice řídké, což znamená, že skoro všichni pacienti s touto chorobou pocházejí z jednoho postiženého rodu. Nemoc je děděna autozomálně dominantně, její projevy nastupují však obvykle až mezi třicátým a padesátým rokem věku, průměrně ve věku 37 let. Jejím hlavním příznakem je hyperkineze choreatického typu. Do plně vyvinutého obrazu patří mimovolní pohyby končetin, mimických svalů a jazyka, okulomotorické poruchy, v rozvinutém stádiu nemožnost chůze a porucha řeči, spolu s psychiatrickými symptomy charakteru poruchy osobnosti a progredující demence. Patologicko-anatomicky nacházíme významný selektivní úbytek neuronů v bazálních gangliích, zejména ve striatu, v pozdních stádiích je postižena i kůra a mozeček. V oblastech změn je výrazná reparativní glióza vláknitého typu a v astroglii nacházíme tzv. gliová tělíska obsahující hnědý pigment typu ceroidu a pigment s vysokým obsahem železa. Byl popsán úbytek aktivity neurotransmiterů GABA, substance P, dynorfinu a met-enkefalinu, radionuklidovými metodami (SPECT, PET) lze prokázat úbytek dopaminových D1 a D2
receptorů a angiotenzinových AT1 receptorů v různých oblastech mozku.
Gen IT-15 pro Huntingtonovu choreu se nachází na krátkém raménku 4. chromozómu (4p16.3). Genový produkt dostal název huntingtin. Tento protein je výrazně exprimován v mozku, ale v menší koncentraci je přítomen i ve všech ostatních tkáních. Jeho fyziologická funkce u zdravých jedinců zůstává nejasná. Uvažuje se o tom, že huntingtin interaguje s dalšími proteiny v cytoplazmě, například s kalmodulinem, a tak ovlivňuje kalciový metabolizmus. U nemocných s Huntingtonovou choreou se uvažuje o možném zvýšení permeability neuronální membrány pro kalcium jako mechanizmu neuronální degenerace 19. Huntingtin se váže s nově objeveným proteinem HAP1 (huntingtin-associated protein) a s neuronální syntetázou oxidu dusnatého (nNOS). Je možné, že v patogenezi Huntingtonovy nemoci hraje oxid dusnatý podobnou roli jako u Duchenovy muskulární dystrofie. Jiná pozorování (snížený glukózový metabolizmus a zvýšené množství laktátu v bazálních gangliích, prokázané metodami PET a protonové NMR spekroskopie), by mohla svědčit pro snížení buněčného energetického metabolizmu jako mechanizmu neuronální degenerace u Huntingtonovy chorey. Tyto bioenergetické změny mohou učinit energeticky insuficientní a částečně depolarizovaný neuron vulnerabilní k excitotoxickému poškození glutamátem. Posledně jmenovanou hypotézu by mohly podporovat pokusy na zvířecích modelech, kdy podávání N-metyl-D-aspartát receptorových agonistů (např. kyseliny chinolinové) nebo 3-nitro-propionové kyseliny, inhibitoru Krebsova cyklu v mitochondriích, mělo za následek patologické změny odpovídající změnám při Huntingtonově choree.
Pacienti s Huntingtonovou choreou mají v genu IT-15 36 až 121 tripletů CAG, zatímco zdraví zde mají těchto tripletů 11 až 34. Čím větší je počet opakování zmíněného tripletu, tím je nástup nemoci časnější a intenzita příznaků závažnější.

Nejnovějšími výzkumy se podařilo objasnit molekulární příčiny čtyř hlavních dědičných ataxií, které zahrnují spinocerebelární ataxii typu 1 (olivo-ponto-cerebelární atrofii), dentato-rubro-pallido-luysiánskou atrofii, Machadovu-Josephovu nemoc, které jsou dědičné autozomálně dominantně, a Friedreichovu ataxii, jež je dědičná autozomálně recesívně. Ačkoli je v klinickém obraze postižení obtížné tyto ataxie navzájem odlišit, jejich přesná molekulárně genetická analýza může být velmi užitečná.
V roce 1993 bylo zjištěno, že spinocerebelární ataxie typu 1 (olivo-ponto-cerebelární atataxie) je vázána na 6. chromozóm (6p22-23). Vyznačuje se ataxií, oftalmoparézou a celkovou slabostí, manifestujícími se v třetí až páté dekádě života, výjimkou však není ani juvenilní nástup choroby. Patologicko-anatomicky zjišťujeme ztrátu neuronů v mozečku (hlavně Purkyňových buněk) a v mozkovém kmeni a degeneraci spinocerebelárních drah. Na příslušném místě genu pro tuto nemoc bylo u postižených prokázáno 40 až 81 opakování tripletů CAG, zatímco u zdravých jen 19 až 36. Zdraví mají navíc mezi repeticemi CAG vmezeřené 1 až 3 trinukleotidy CAT, jež mají zřejmě zajišťovat stabilitu alel. (Podobné přerušení nacházíme také u FMR-1 genu, kdy je souvislý sled repeticí CGG přerušen několika pravidelně rozestavěnými triplety AGG.) Stejně jako u ostatních nemocí se zvýšeným počtem opakování tripletů DNA, i zde byla negativní korelace mezi počtem těchto tripletů a věkem, kdy došlo k nástupu choroby, a tzv. genetická anticipace, totiž že v následujících generacích se jak penetrance a expresivita, tak počet tripletů zvětšuje. CAG triplety se exprimují do polyglutaminů v genovém produktu, který dostal název ataxin-1.
V roce 1994 byly popsány opakované CAG triplety u dentato-rubro-pallido-luysiánské atrofie (geneticky a patologicko-anatomicky totožnou s Haw River syndromem, avšak klinicky se ve srovnání s ním poněkud jinak manifestující), která se vyznačuje progresívní ataxií, svalovou dystonií, myoklonem, choreathetózou, epileptickými záchvaty a demencí. Někdy může klinicky připomínat Huntingtonovu choreu, ale histologicky zde prokazujeme dentatorubrální atrofii při nepřítomnosti atrofie striátální. Je vázána na krátké raménko 12. chromozómu (12p12). V roce 1994 bylo zjištěno, že na příslušném genu se normálně vyskytuje 7 až 25 repeticí CAG, zatímco u pacientů s touto chorobou je jich 49 až 88. Genový produkt byl nazván atrofin-1.
Gen pro jednu z nejčastějších dědičných spinocerebelárních degenerací, Machadovu-Josephovu nemoc leží na 14. chromozómu (14q24.3-q32). Často je obtížné klinicky ji odlišit od spinocerebelární ataxie typu 1. Kawaguchi popsal v roce 1994 u pacientů s touto nemocí 61 až 84 opakovaných sekvencí CAG, zatímco u zdravých jich bylo nalezeno 12 až 37.
Nejčastější dědičnou ataxií je Friedreichova ataxie. Její výskyt se odhaduje na 1 : 50 000, nosičem jejího genu je pak zhruba každý dvoustý člověk v populaci. Dochází při ní k atrofii zadních míšních provazců, Flechsigova a ventrálního Gowersova svazku a degeneraci gangliových buněk Clarkova jádra. Jejími příznaky je ataxie končetin s vymizením reflexů na dolních končetinách a pozitivním Babinského znamením, cerebelární dysartrie a senzorické poruchy. Je doprovázena hypertrofickou kardiomyopatií a zvýšeným rizikem diabetu. Nemoc začíná většinou před dvacátým rokem života a neodvratně progreduje. Prakticky neodlišitelný klinický obraz může způsobit recesívně dědičná endogenní deficience vitamínu E, jež je geneticky kódována na dlouhém raménku chromozómu 8 (8q13.1-13.3), kde je umístěn gen kódující protein a-TTP, který váže alfa-tokoferol.
Gen X25 pro Friedreichovu ataxii byl lokalizován na devátém chromozómu (9q13-q21.1). V roce 1996 bylo zjištěno, že má pět exonů o délce přes 40 kb, které kódují protein o 210 aminokyselinách, jenž byl nazván frataxin. Vysoký obsah tohoto proteinu byl zjištěn v centrální nervové soustavě, hlavně v míše a v dalších oblastech postihovaných nemocí. Uvedenými výzkumy bylo prokázáno, že nemocní s Friedreichovou ataxií mají v intronu 1, nekódující oblasti genu X25, 200 až 900 opakování trinukleotidu GAA, zatímco zdraví jich měli jen 7 až 22. U nemocných byla zjištěna extrémně nízká hladina transkribované mRNA, což svědčí o tom, že nemoc musí být způsobena ztrátou funkce frataxinu. V poslední době je navrhována hypotéza, že zvýšený počet opakování tripletu GAA v intronu 1 může interferovat s posttranskripční modifikací mRNA. Nemoc je dědičná autozomálně recesívně, většina nemocných jsou proto homozygoti s GAA expanzí, byli však zjištěni i postižení heterozygoti, kteří měli v druhé alele bodovou nukleotidovou mutaci. To se zdá být důležité pro porozumění molekulární patogenezi nemoci, neboť to znamená, že pro narušení posttranskripční modifikace mRNA, vykonávané spliceosomem, postačuje jak bodová mutace, tak trinukleotidová expanze.

Friedreichova ataxie je nemoc vyvolaná mutací, která způsobuje ztrátu funkce genového produktu (loss-of-function mutation). Naproti tomu, molekulární mechanismus autosomálně dominantně dědičných onemocnění způsobených zvýšeným počtem nukleotidových tripletů v genu, jako je Huntingtonova chorea, spinocerebelární atrofie typu 1, dentato-rubro-pallido-luysiánská atrofie a Machado-Josephova nemoc, u nichž expanze trinukleotidu CAG ústí v syntézu proteinu obsahujícího dlouhý polglutaminový řetězec, je dán toxickým účinkem genového produktu (gain-of-function mutation). Výše zmíněnou hypotézu o neuronální degeneraci jako následku snížení energetického metabolizmu buňky podporuje i poznatek, že huntingtin a atrofin selektivně interagují prostřednictvím svého polyglutaminového řetězce s enzymem glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázou (GAPDH), který inhibují.
Objev dynamických mutací v genech zodpovědných za uvedené dědičné neurodegenerativní nemoci jako nový patogenetický mechanizmus nás velmi přiblížil ke kauzálnímu pochopení těchto chorob na molekulární úrovni. Umožňuje nám vysvětlit jejich dříve neobjasnitelné aspekty. Tyto poznatky nám pomáhají zpřesnit diferenciální diagnózu, genetické poradenství a prognózu. V budoucnosti snad bude možné využít tyto informace k rozvinutí efektivní kauzální léčby, což by mohla být zřejmě genová terapie. V renomovaných světových laboratořích se v současné době pátrá po dalších nemocech, které patrně spektrum chrorob vyvolaných expanzí nukleotidových tripletů ještě rozšíří. Odpověď na otázky, proč intenzita příznaků těchto nemocí a věk, ve kterém se příznaky manifestují, korelují s počtem nadbytečných tripletů, proč zde dochází ke genetické anticipaci (zvyšující se penetranci a expresivitě v následujících generacích), co je genetickou příčinou zahájení nestability repetice, jakým mechanismem expandované repetice vedou k neuronální degeneraci a proč dochází u některých těchto chorob k systémovému postižení, bude dalším zajímavým přínosem molekulární biologie.

Literatura:
1. Rosenberg, R. N. 1996. DNA – Triplet Repeats and Neurologic Disease. NEJM 335:1222-1224.
2. Martin, J. P., Bell, J. 1943. A pedigree of mental defect showing sex – linkage. Journal of Neurology and Psychiatry 6: 154-157.
3. Lubs, H. A. 1969. A marker X chromosome. AJHG 21: 231 – 244.
4. Thompson, M. W. Genetics in Medicine. Fourth edition. Thompson edition..
5. Mange, A. P., Mange, E. J. 1990. Genetics: Human Aspects. Sinauer Associates Inc..
6. Gelehrter T. D., Collins, F. S. 1990. Principles of Medical Genetics. Williams and Williams..
7. Cummings, M. R. 1988. Human Heredity. West Publishing Company. 142-143.
8. Turner, G., Jacobs, P. 1983. Marker (X) – linked Mental Retardation. Adv Hum Genet 13: 83 – 112.
9. Sherman S. L., Morton, N. E., Jacobs, P. A. , Turner, G. 1984. The Marker (X) – syndrome: a cytogenetic and genetic analysis. Ann Hum Genet 48: 21-37.
10. Kremer, E.J., Pritchard, M., Lynch, M. et al. 1991. Mapping of DNA instability at the fragile X to a trinucleotide repeat sequence
p (CCG)n. Science 252: 1711-1714.
11. Piretti, M., Zhang, F. P., Imbert, G. et al.
1991. Absence of expression of the FMR-1 gene of fragile X syndrome. Cell 66: 817-22.
12. Devys, D., Lutz, Y. , Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L.1993. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet 4: 335-40.
13. La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B. et al. 1991. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature 352: 77-79.
14. Brook, J. D., McCurrach, M. E., Harley, H. G. et al. 1992.Molecular basis for myotonic dystrophy: expansion od a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell 68: 799-808.
15. Weeks, R. A., Piccini, P. et al. 1996. Striatal D1 and D2 dopamine receptor loss in assymptomatic mutationcarriers of Huntington’s disease. Ann Neurol 40: 49-54.
16. Ge, J., Barnes, N. M. 1996. Alterations in angiotensin AT1 and AT2 receptor subtype in brain regions from patients with neurodegenerative disorders. Eur J Pharmacol 297: 299-306.
17. Kalchman,M. A., Graham, R. K., et al. 1996. Huntingtin is ubiquitinated and interacts wits a specific ubiquitin-conjugating enzyme. J Biol Chem 271: 19385-19394.
18. Bao, J., Sharp, A.H. et al. 1996. Expansion of polyglutamine repeat in huntingtin leads to abnormal protein interactions involving calmodulin. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 5037-42.
19. Akbarian, S, Smith, M. A. Jones, E.G. 1996. Editing for an AMPA receptor subunit RNA in prefrontal cortex and striatum in Alzheimer’s disease, Huntington’s disease and schizofrenia. Brain Res 699: 297-304.
20. Huntingtin-associated protein (HAP1) : discrete neuronal localisations in the brain resemble those of neuronal nitric oxide synthase. 1996. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 4839-44.
21. Brandt, J., Bylsma, F. W., Gross, R. et al. 1996. Trinukleotide repeat leghth and clinical progression in Huntington’s disease. Neurology 46: 527-531.
22. Orr, H. T., Chung, M., Banfi, S. et al. 1993. Expansion of an unstable trinukleotid CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1. Nat Genet 4: 221-226.
23. Koide, R., Ikeuchi, T., Onodera, O. et al. 1994. Unstable expansion of CAG repeat in hereditary dentatorubral-pallidoluysian athrophy (DRPLA). Nat Genet 6: 9-13.
24. Nagafuchi S., Yanagisawa M., Sato, K. et al. 1994 Dentatorubral and pallidoluysian atrophy expansion of an unstable CAG trinukleotide on chromosome 12p. Nat Genet 6: 14-18.
25. Takiama, Y., Nishizava, M., Tanaka, H., et al. 1993. The gene for Machado-Joseph disease maps to human chromosome 14q32.1. Nat Genet 4: 300-304.
26. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., et al. 1994. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat Genet 8: 221-228.
27. Takanari G., Makoto, A., Hyroyuki, A., et al. 1995. Adult-onset spinocerebellar dysfunction caused by a mutation in the gene for the
a-tocoferol-transfer protein. NEJM 333: 1313-1318.
28. Chamberlain, S., Shaw, J., Rowland, A., et al. 1988. Mapping of mutation causing Friedreich’s ataxia to human chromosome 9. Nature 349: 248-250.
29. Campuzano, V., Montermini, L., Molto, M. D., et al. 1996. Friedreich’s ataxia: autosomal recesive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science 271: 1423-1427.
30. Burke, J. R., Enghild, J. J., Martin, M. E., et al. 1996. Huntingtin and DRPLA proteins selectively interact with the enzyme GAPDH. Nat Med 2: 347-350.
31. Paulson, H. L., Fishbeck, K. H. 1996. Trinucleotide repeats in neurogenetic disorders. Annu Rev Neurosci 19: 79-107.

Reklamy

Josef Reischig


14. března 2011 v 14:41 | Petr Kufner | Vzpomínky na přátele

23. srpna 2010 v 8:41 | MUDr. Petr Kufner
ŽIVOT JOSEFA REISCHIGA BYL VNITŘNÍM OBOHACENÍM PRO VŠECHY KDO HO ZNALI …
Když jsme v roce 2005 přáli Josefu Reischigovi všechno dobré k jeho šedesátým narozeninám, nikoho z nás by určitě nenapadlo, že za pouhé další tři roky se budeme naposledy loučit s tímto povolaným vědcem, velkorysým přednášejícím zaujatým pro svůj obor biologie a genetiky, originálním umělcem a v neposlední řadě všestranným, houževnatým a po všech stránkách odolným sportovcem tělem i duší. A nelze nepřipomenout to, co je určitě nejdůležitější – Josefovy neobyčejné, vpravdě lidské kvality umocněné poctivě žitým křesťanstvím. Velkou celoživotní oporou byla Josefovi jeho paní Libuška, se kterou vychovali Tomáše a Petra, dva syny připravené obstát v životě podle vzoru svých rodičů. Josef Reischig se narodil v Nymburce 6. srpna 1945. Shodou okolností, která by byla možná zajímavou pro numerologa nebo astrologa, datum jeho narození je shodné se dnem, kdy nad japonskou Hiroshimou vybuchla atomová bomba a byla tak napsána definitivní tragická tečka za více než 60 milióny lidských obětí ve druhé světové válce. Pan docent vyrůstal ve velké rodině – byl druhým nejstarším z pěti sourozenců. Tatínek byl stavební inženýr a projektoval hlavně mosty. Hodně se také věnoval sportu, zejména lehké atletice. Početná rodina byla Pepíkovi darem, díky kterému se naučil skromnosti a pokoře – vlastnostem které se táhnou jako červená nit celým jeho dalším životem a to i po nástupu vážného onemocnění. Nikdy si v nemoci ani jindy nestěžoval a jen málo z nás vědělo, jak se statečností a trpělivostí člověka formovaným kromě jiného i sportem „nesl svůj kříž a zapíral sám sebe“. První principy vzdělání získal Josef Reischig na základní škole a později na gymnáziu v Praze-Strašnicích. Když v roce 1963 složil maturitní zkoušku, přemýšlel o tom, jestli začít studovat na Fakultě tělesné výchovy a sportu University Karlovy v Praze nebo na Přírodovědecké fakultě téže university. Po krátkém váhání se rozhodl pro „kompromis“ – začal studovat současně na obou těchto vysokých školách. Při sportu se pozoruhodně uplatnil jeho vrozený, mimořádně všestranný talent. Věnoval se tehdy hlavně lehké atletice, kde pro svůj výborný odraz dosahoval pozoruhodných výsledků ve skoku vysokém. Ještě více ho přitahoval hokej a někteří spoluhráči, se kterými dříve trénoval, byli později nominováni do reprezentačního výběru tehdejšího Československa. Aktivní účast na vrcholovém sportu vyústila v úvahy o tom, že by Josef mohl nastoupit cestu profesionála trénujícího vrcholové sportovce. Navzdory poměrům, v době srpnové sovětské tankové invaze 1968 a v následujícím vzrušeném roce blížící se Husákovy „normalizace“, docent Reischig dostudoval obě vysoké školy a získal postupně diplomy na fakultě tělesné výchovy a sportu i na přírodovědecké fakultě. Na posledně jmenované fakultě se stal asistentem katedry systematické zoologie. Poté se přestěhoval do Plzně kde pokračoval ve své vědecké a pedagogické práci jako asistent na ústavu biologie (tehdy byl tento ústav formálně součástí „Katedry chemie, biofyziky a biologie LF UK v Plzni“. Při této práci úspěšně studoval na Přírodovědecké fakultě UK v Praze a nakonec získal titul „Doctor rerum naturalium.“. Počátkem 70. let ovlivnil jeho vědecké zaměření tehdy již ostřílený vědec docent Vlastimil Habermann. Ten mu dal za úkol spolupracovat při instalaci metody přímé vizualizace virových nukleových kyselin elektronovým mikroskopem. Docent Reischig tehdy pracoval především s virem Epstaina-Baarové a s virem herpes simplex.Tato spolupráce se vydařila a zároveň znamenala přínos v podobě originálního souboru zveřejněných prací. Řada těchto sdělení byla přijata do mezinárodních vědeckých časopisů, například do prestižního Virology. Dva roky po konci čtyřicetiletého vládnutí komunistické strany se Josef Reischig stal docentem na Lékařské fakultě UK v Plzni. V letech 1993 a 1995 absolvoval studijní pobyty v Marseille na Unité de Recherches sur les Rétrovirus et Maladies Associées. Zde se seznamoval s moderními názory a poznatky týkajícími se výzkumu HIV. Právě před deseti lety, JR převzal po docentu Tomáši Magrotovi vedení ústavu biologie. V osobnosti Josefa byly vedle již zmíněných nevšedně dobrých lidských vlastností vyváženě zastoupeny znalost oboru, učitelská kompetence a schopnost kladně motivovat spolupracovníky. Mladým spolupracovníkům umožňoval rozvíjet vědecký a pedagogický talent. I v nesnadných situacích měl pevné nervy a vždy se dokonale ovládal. Pokud došlo na ústavu něčí vinou k občasnému většímu pochybení, mohli jsme zaslechnout Pepíkův klidný hlas pronášející výtku v žargonu hokejistů k obránci, který zavinil gól: „To se ti teda nepovedlo…“ Docent Reischig položil na našem ústavu základy Referenční laboratoře světelné mikroskopie a Laboratoře konfokální mikroskopie, které jsou dvěma unikátními pracovišti v rámci Karlovy University. V těchto laboratořích dominuje v současné době nejmodernější konfokální mikroskop Olympus Fluoview 1000. JR měl jako vnímavý pozorovatel přírody potřebu zobrazovat objekty její krásy (viz názvy více než dvaceti výstav Reischigových fotografií pořízených mikroskopem „Pohled do mikrosvěta. Skrytá krása stvoření“). Jednalo se u něho v tomto ohledu o skutečné zapálení, jak pro předměty pozorovatelné okem tak mikroskopem. V oboru fotografie a filmu vyrobil docent Reischig sérii krátkých populárně – naučných filmů a snímek „Prvoci – bičíkovci“ (2000) dostal jednu z hlavních cen Academia filmu Olomouc. Zájem o malířství, fotografii, přírodu, mikroskopy sjednotil JR, lze takřka říci v avantgardní výtvarné metodě, čerpající ze zobrazení nejrůznějších objektů pod zorným polem mikroskopu. Pod mikroskopem vyfotografoval Josef stovky jsoucen živé i neživé přírody. Uveďme namátkou například řez stonkem rostliny, kapiláry v tukovém lalůčku, síť neuronů (zde spolupracoval s docentem Františkem Vožehem), krystaly kyseliny askorbové či dopaminu, v neposlední řadě pak krystalizující DNA. Desítky těchto fotografií byly převzaty do knih i časopisů (jmenujme alespoň časopis Vesmír, v jehož prakticky každém čísle jsou publikovány Reischigovy fotografie). Současná vzpomínka na Josefa Reischiga není prosta smutku. Jsme rádi, že jsme mohli prožít v našem přátelství řadu let, společně ve všem dobrém i zlém. Řada z nás věří, že již přistál na onom druhém břehu, kde obdržel zaslouženou odměnu. Petr Kufner, 14.6.2010

 

Zdravý vývoj lidské osobnosti


13. března 2011 v 21:40 | Petr Kufner | Psychologie

Velká řada směrů v oblasti psychologie vychází z předpokladu, že člověk je svobodná bytost, to znamená, že není ve svém konání zcela úplně determinován faktory směřujícími k němu z okolí, z vnějšku. Z lidské svobody pak plyne nevyhnutelně zodpovědnost – každý je do značné míry zodpovědný, kromě jiného, za své fyzické, duševní a duchovní zdraví. Tak, jako člověk způsobem svého života ovlivňuje své fyzické zdraví, je schopen ovlivňovat i své duševní a duchovní zdraví – to, zda se vyvíjí ve zdravou a harmonickou osobnost a stává se skutečně tím, kým má být. Možná každý z nás má zkušenost setkání s člověkem, v jehož přítomnosti získal pocit neviditelného obohacení a vnímal, že tato osoba mu předává velké vnitřní hodnoty. Takto na nás působícím lidem se někdy říká „podporovatelé osobnostního růstu“ (termín je od amerického psychologa M. R. McMillana). Naopak v přítomnosti některých jiných lidí se můžeme cítit stísnění, vzbuzují v nás pesimistický pohled na život, vyvolávají nepříjemné emoce a odcházíme od nich nikoli harmonicky naladěni, nýbrž ve vnitřní rozvrácenosti. Takovýmto lidem říká McMillan „letální osobnosti“ (latinské letalis = zhoubný, smrtící).
Je důležité naučit se tyto krajní dva typy osobností vědomě rozlišovat. Styku s „letálními osobnostmi“ se samozřejmě nelze v životě nikdy úplně vyhnout, a tak je dobré jej odměřovat podle našich momentálních dispozic a kompenzovat jeho negativní dopad na nás častým stykem s „podporovateli osobnostního růstu“. Máme štěstí nalezneme-li takového „podporovatele“ ve svém partnerovi, rodiči či příteli, můžeme jej ale nalézt u lékaře, terapeuta, kněze- jsou-li skutečně způsobilými k tomuto povolání.

Můžeme si položit tyto otázky : Jak působíme na druhé lidi (na naše přátele, známé a ty nejbližší, zejména děti) my? Napomáháme jejich osobnostnímu růstu, a tím v nich podporujeme komplexní zdraví, nebo v nich osobnostní růst spíše potlačujeme, nebo dokonce zabíjíme? Odcházejí od nás druzí něčím obohaceni?
V psychologickém výzkumu převládá tendence vycházet z chorobných projevů, pozorovaných u klientů. Tak například psychoanalýza staví svou teorii osobnosti na chorobných příznacích, se kterými se setkáváme u tzv. neuróz. Někteří psychologové se pokusili založit svou teorii naopak na pozorování zdravých, nadprůměrně tvořivých lidí. Mezi tyto psychology patří, u nás poměrně dost málo známý americký psycholog Abraham Maslow (1908-1970). Zkoumal, jakými společnými faktory se vyznačuje život jedinců, kteří „své lidství rozvinuli do plnosti, zralosti a „dosáhli hlubokého štěstí, pokoje a bohatství ve vnitřním životě“.  Našel u nich tyto společné charakteristiky:
1. Dobrý kontakt s realitou a z něho plynoucí dobrá orientace v mezilidských vztazích – schopnost postřehnout faleš, přetvářku a nečestnost. Současně soulad s pravdivostí a skutečností ve všech sférách života.

2. Vysoký stupeň vlastního sebepřijetí, ale také přijímání druhých lidí a všecho, co je člověku vlastní. Jsou schopni přijmout i nedostatky a omezení, a to jak u sebe samotných, tak u druhých.

3. Spontánnost, jednoduchost a přirozenost v myšlení, citech a v chování. Dávají přednost společnosti, která jim umožňuje být sebou samotnými.

4. Nestavějí do středu své pozornosti výhradně své vnitřní problémy, ale jsou schopni se soustředit na úkol, povinnost nebo poslání, které jim bylo určeno jako životní.

5. Potřeba soukromí. Nevyhýbají se samotě, kterou naopak využívají jako příležitost k hluboké koncentraci na předmět svého zájmu a k modlitbě či k meditaci.

6. Zůstávají věrni svému přesvědčení i v situaci odmítání druhými a nepopularity. Jsou schopni prosazovat své myšlenky i tehdy, když je to bolestné. Nejsou podřízeni úsudku druhých, a proto jsou poměreně stabilní i při vystavení tvrdým ranám, strádáním a frustracím.

7. Váží si zdánlivě každodenních skutečností života jako jsou třeba květiny, stromy, dítě, zralé osoby, západu slunce. Dovedou vidět jedinečné stránky i obyčejných věcí.

8. „Sebeaktualizující osoby“ často prožívaly tzv. „vrcholné zážitky“, blížící se mystickému sjednocení s Bohem při prožívání lásky, krásy, dobra.

9. Tito lidé mají schopnost prožívat lidské bratrství a sounáležitost všeho lidstva.

10.Jsou schopny intenzívních přátelských vztahů. Měly alespoň jednoho nebo dva blízké lidi. Dávají však přednost několika hlubokým lidským vztahům před mnoha povrchními.

11.Demokratické smýšlení. Nehodnotí lidi na základě nějakých skupinových znaků (národnost, rasa, stav, náboženství apod.), ale každého člověka chápou jako neopakovatelného a jedinečného.

12.Silně vyvinutý etický cit, rozlišování mezi dobrem a zlem. Své chování podřizují svému mravnímu smýšlení.

13.Smysl pro humor, který však nezraňuje druhé (tzv. „humor bez nepřátelství“).

14.Tvořivost (kreativita). Dovedou originálně používat svou fantazii při řešení problémů v nejrůznějších oblastech života. Nejsou pouhými následovníky zaběhaného myšlení, ale dovedou hledat nové cesty.

15.Nedají se slepě ovlivňovat kulturou, módou nebo reklamou, uchovávají si svou vlastní svobodu a nezávislost na okolí. Nejsou například bezmezně oddáni ekonomickému pokroku, který je jakýmsi moderním náboženstvím, a v jehož jménu jsou ničeny rostlinné a živočišné druhy, je devastována půda, voda i vzduch.

Někteří psychologové zaznamenali u takovýchto osob některé další charakteristiky, mezi něž patří pozitivní zkušenosti z dětství (bezpečné prostředí, láska rodičů) a dále schopnost dát negativním zkušenostem (těžká nemoc, ztráta milované osoby, neúspěch v zaměstnání, vězení, chudoba) pozitivní účinek. Posledně jmenovanou schopností se podrobně zabývá logoterapie (řecky logos = slovo, smysl, duch, též Slovo Boží), založená Viktorem E. Franklem (nar. 1905 ve Vídni, rodina pocházela z Pohořelic u Brna, zemřel v r. 1997). Frankl, který byl až do svých dvaadevadesáti let schopen přednášet na předních světových univerzitách, vydal svým životem nejlepší svědectví o platnosti své nauky. Prožil několik let v koncentračním táboře, rukopis jeho mnohaletého díla mu byl po příchodu do tábora vyrván a zničen. Pod vlivem zkušeností z tábora smrti se však jeho myšlenky vytříbily a dozrály. I ty nejtěžší stránky života, jako je nemoc, utrpení, vina a smrt, dávají člověku příležitost k růstu tím, že objeví jejich poselství, smysl a zaujme k nim správný postoj. Promění tak utrpení v morální vítězství, a tím nalezne nejhlubší smysl života. Frankl popisuje prožitek svého umírajícího pacienta, který říká: „Byl jsem naplněn citem lásky k celému lidstvu, pocitem vesmírné nezměrnosti.“ Jinou umírající pacientku Viktor E. Frankl představil svým 150 studentům medicíny, psychologie a teologie na přednášce, která byla zakončena spontánním potleskem. Frankl na to reagoval slovy: „Podívejte se, paní Linková, tento potlesk patří vám. Patří vašemu životu, který byl jediný velký výkon. Můžete být hrdá na svůj život! A jak málo je lidí, kteří mohou být hrdi na svůj život! Chtěl bych říci, paní Linková: Váš život je pomník! Pomník, který žádný člověk nemůže sprovodit ze světa.“
To, zda budeme šťastni – jak v toku svého života, tak i na jeho konci – záleží na tom, zda se nám podaří zodpovědět otázku po smyslu. Velký krok na cestě ke štěstí udělal již ten, kdo si tuto otázku vůbec položil. Hledání odpovědi po smyslu života je proces trvající dlouhou dobu, ale pokud se rozhodneme se takto ptát, vyhneme se na konci života pocitu, že jsme jej prožili zbytečně.

Scanning Confocal Microscope Detection of Nuclear Actin Using Green Fluorecent Protein (GFP)


17. září 2010 v 14:34 | Cell Biology

„Průkaz jaderného aktinu skenovacím konfokálním mikroskopem pomocí zeleně fluoreskujího proteinu GFP“
(Abstract), in Czech.
P. Kufner, L. Hájková J. Reischig, M. Salášek
Charles Univ. in Praque, Faculty of Medicine in Pilsen, Institute of Biology.

Transgenic Drosophila larvae were studied with respect to the expression and distribution pattern of GFP-coupled proteins. Larval organs were isolated and the fluorescent signal scrutinized using laser scanning confocal microscopy. Cytoplasms, nuclei, and non-cellular backgrounds were submitted to spectral analysis and fluorescence intensity measurements. The cell line expressing GFP-actin exhibited both cytoplasmic and nuclear staining, which was not the case in the remaining two cell lines, whose staining was exclusively cytoplasmic, and which can in this respect be considered as negative controls. The presence of actin in the eukaryotic nucleus has not been unequivocally accepted by the scientific community and the observations remained an enigma until the very recent years when several examples of nuclear functions of actin have been demonstrated. Our findings may represent a significant contribution to the growing understanding of the role of actin in the nucleus.

Melatonin protects mitochondrial transmembrane potential from the effect of antimycin A in normal as well as cancer cell lines


Melatonin protects mitochondrial transmembrane potential from the effect of antimycin A in normal as well as cancer cell lines 6. listopadu 2008 v 11:42 | MUDr. Petr Kufner, MUDr. Lucie Hájková, Ph.D., Doc. MUDr. Josef Reischig, CSc. | Cell Biology Melatonin (N-acetyl-5-metoxytryptamin) has been reported to have beneficial effects in an ever growing number of … Celý příspěvek

Melatonin and mitochondrial transmembrane potential


Melatonin protects mitochondrial transmembrane potential from the effect of antimycin A in normal as well as cancer cell lines

6. listopadu 2008 v 11:42 | MUDr. Petr Kufner, MUDr. Lucie Hájková, Ph.D., Doc. MUDr. Josef Reischig, CSc. | Cell Biology
Melatonin (N-acetyl-5-metoxytryptamin) has been reported to have beneficial effects in an ever growing number of pathological conditions. This hormone produced predominantly by the pineal gland is well-known for its direct (ROS scavenger), as well as many indirect antioxidative effects, and is therefore a promising candidate for a therapeutic agent possibly with a minimal level of inauspicious side effects. Deeper understanding is required before its routine clinical use, however.
Ischemia-reperfusion injury (IRI), a typical phenomenon in various ischemia-related pathological states including organ transplantations, is caused by an overproduction of reactive oxygen species (ROS) in the reperfused tissue. The ROS cause cellular oxidative stress and tissue damage.
The aim of our efforts has been to design a model for monitoring and treatment of hypoxia-related processes. We have established an assay for a study of cellular oxidative stress using cultured mammalian cells. As a measure of the oxidative state of the cells, mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) was chosen. The potential was monitored in live cells stained with the fluorescent probe JC-1, whose transition between the monomeric state and JC-1 aggregates, accompanied by a shift of the emission wavelengths (from λ = 529nm to λ = 590nm), is dependent on the value of the mitochondrial transmembrane potential. Live adherent cells of various cell lines (cancerous as well as normal, of mammalian origin including human), grown on the bottom glass of a Bachofer perfusion chamber, were observed in the Olympus Fluoview1000 laser scanning confocal microscope, using fluorescent as well as DIC microscopy.
Obrázek 1:
The oxidative cellular stress was induced chemically by addition of antimycin A, a specific inhibitor of complex III of the respiratory chain, an activity corresponding to that of nitric oxide.
The effect of antimycin A (inner mitochondrial membrane depolarization) was measured as a ratio of average relative fluorescence intensities in the green (IF(G)) and red (IF(R)) channelsrespectively, (IF(G))/(IF(R)).
Detection and quantification of the fluorescent signals were optimized through exciting both the JC-1 monomers and JC-1 aggregates by 488nm laser, and submitting the emissions to a strict spectral separation to eliminate any overlap of the signals in the area between the emission peaks. A minimum of ten view fields per every sample were scanned and quantified.
This model was thereafter employed to examine the
potential cytoprotective effect of melatonin against the consequences of the oxidative challenge.
Obrázek 2
Pretreatment of the cells with melatonin before their exposure to antimycin A lead to a drop in the previously observed antimycin-induced decrease of mitochondrial transmembrane potential, thus implicating an antioxidative cytoprotective effect of melatonin in this system. A statistically significant decrease in the IF(G)IF(R) ratio was observed. Hence, melatonin stabilizes the mitochondrial transmembrane potential in the studied cell lines and protects the cells against oxidative stress.
The above appears to be a suitable method for estimating and comparing the protective effects of antioxidants with a therapeutic potential.